酵母人工染色体

在 YAC载体中最常用的是 pYAC4 。由于酵母的染色体是线状的，因此其在工作状态也是线状的。但是，为了方便制备YAC载体， YAC 载体以环状的方式存在，并增加了普通大肠杆菌质粒载体的复制元件和选择标记，以便保存和增殖。

YAC 载体的复制元件是其核心组成成分，其在酵母中复制的必需元件包括复制起点序列即自主复制序列（autonomously replicating sequence， ARS）、用于有丝分裂和减数分裂功能的着丝粒（centromere , CEN）和两个端粒（TEL）。

YAC 载体为能够满足自主复制、染色体在子代细胞间的分离及保持染色体稳定的需要，必须含有以下元件：

YAC 载体的选择标记主要采用营养缺陷型基因，如色氨酸、亮氨酸和组氨酸合成缺陷型基因 trp 1、 leu 2和 his 3、尿嘧啶合成缺陷型基因 ura3 等，以及赭石突变抑制基因 sup4 。与 YAC 载体配套工作的宿主酵母菌（如AB1380）的胸腺嘧啶合成基因带有一个赭石突变ade 2-1。带有这个突变的酵母菌在基本培养基上形成红色菌落，当带有赭石突变抑制基因 sup4 的载体存在于细胞中时，可抑制 ade 2-1基因的突变效应，形成正常的白色菌落。利用这一菌落颜色转变的现象，可用于筛选载体中含有外源DN******段插入的重组子。

YAC 载体主要是用来构建大片段 DNA 文库，特别用来构建高等真核生物的基因组文库，并不用作常规的基因克隆。图3-26是 pYAC4 的遗传结构图，当用BamHⅠ切割成线状后，就形成了一个微型酵母染色体，包含染色体复制的必要顺式元件，如自主复制序列、着丝粒和位于两端的端粒。这些元件在酵母菌中可以驱动染色体的复制和分配，从而决定这个微型染色体可以携带酵母染色体大小的 DNA 片段。图3-27描绘了 YAC 载体的原理性工作流程。对于切割后形成的微型酵母染色体，当用或SmaⅠ切割抑制基因 sup4 内部的位点后形成染色体的两条臂，与外源大片段 DNA 在该切点相连就形成一个大型人工酵母染色体，通过转化进入到酵母菌后可象染色体一样复制，并随细胞分裂分配到子细胞中去，达到克隆大片段DNA 的目的。装载了外源 DNA 片段的重组子导致抑制基因 sup4 插入失活，从而形成红色菌落； 而载体自身连接后转入到酵母细胞后形成白色菌落。这些红色的装载了不同外源 DNA 片段的重组酵母菌菌落的群体就构成了 YAC 文库。 YAC 文库装载的 DNA 片段的大小一般可达 200-500kb，有的可达 1Mb 以上，甚至达到 2Mb 。

YAC 载体功能强大，但有一些弊端。这主要表现在 3 个方面：首先，在 YAC 载体的插入片段会出现缺失（deletion） 和基因重排（rearrangement） 的现象。其次，容易形成嵌合体。嵌合就是在单个 YAC 中的插入片段由 2 个或多个的独立基因组片段连接组成。嵌合克隆约占总克隆的 5%～50% 。最后， YAC 染色体与宿主细胞的染色体大小相近，影响了 YAC 载体的广泛应用。 YAC 染色体一旦进入酿酒酵母细胞，由于其大小与内源的染色体的大小相近，就很难从中分离出来，不利于进一步分析。但是 YAC 的一个突出优点是，酵母细胞比大肠杆菌对不稳定的、重复的和极端的 DNA 有更强的容忍性。另外， YAC 在功能基因和基因组研究中是一个非常有用的工具。由于高等真核生物的基因大多数是多外显子结构并且有长长的内含子，大型基因组片段可通过 YAC 载体转移到动物或动物细胞系中，进行功能研究。